HCS Pharma – BIOMIMESYS® 3D technology
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BIOMIMESYS®是由法國HCS Pharma公司（以下簡稱HCS）開發的3D培養技術，能夠製造出具備生物學特性的細胞外基質(extra-cellular matrix, ECM)結構來培養細胞。BIOMIMESYS®產品是透過己二醯肼(Adipic acid dihydrazide, ADH)進行交叉鏈結(crosslinking)作用來製造，原料包括水溶性改質玻尿酸(Hyaluronic Acid, HA)跟細胞外基質成分(膠原蛋白、纖連蛋白等)，藉此形成ECM結構。 |
玻尿酸在ECM扮演數種不同功能的重要角色。這個醣胺聚醣(glycosaminoglycan, GAG)類分子擁有聚合的能力，能夠形成支架般的構造以維持組織結構。此外，這個分子有跟水分子結合的功用，能夠將水吸附在表面藉此跟數種不同的生長因子結合。
目前，HCS公司已經創建了一種使用玻尿酸作為生物聚合物來合成製造3D細胞培養系統的程序，以此能夠保持玻尿酸的所有特性，進而讓仿造出來的ECM具備所有生物特性（相同的結構、細胞吸附性、儲水性、信號庫等等）。HCM的BIOMIMESYS®技術是目前市面上唯一能讓仿造ECM的培養基同時具有維持固態跟與跟水分子結合兩種特性的技術，藉此得以讓水附著在上面。由於有這兩種特性，HCS又將此3D培養系統稱為水支架（hydroscaffold）。
由於不同的器官、細胞外基質在組成成分跟比率上會有所不同，導致細胞環境在密度、緊密上也或多或少有所不同（不同的彈性係數、孔隙率等）。BIOMIMESYS®的3D培養技術讓HCS Pharma能夠依狀況調整，仿造每個器官不同的細胞環境。
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操作手冊列表(PDF頁面開啟)
BIOMIMESYS® composition
BIOMIMESYS® First steps
BIOMIMESYS® hydroscaffold subcutaneous implantation
BIOMIMESYS® Immunofluorescent markers
BIOMIMESYS® Preparation of samples for histological-labelling
BIOMIMESYS® Protein extraction
BIOMIMESYS® Preparation of samples for scanning electron microscopy
BIOMIMESYS® Protocol for metabolic activity determination
Retrieval of cells from BIOMIMESYS® hydroscaffolds
教學影片
- BIOMIMESYS® tutorial : The complete cell seeding process in a new plate
- BIOMIMESYS® tutorial : How to change medium
- BIOMIMESYS® tutorial : How to simply extract the hydroscaffold
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BIOMIMESYS® Adipose tissue
BIOMIMESYS® Adipose Tissue(脂肪組織) 是一種具備生物機能的玻尿酸（HA）水支架，含有脂肪組織細胞外基質成分，包括：膠原蛋白I、膠原蛋白VI和纖連蛋白的細胞結合領域（RGDS）。BIOMIMESYS® Adipose Tissue提供誘導性微環境，能讓培養的前脂肪細胞在這環境中完全分化。這些前脂肪細胞受誘導後，就會像在in vivo環境內生長時一樣，分化為圓形脂肪細胞，並且對脂肪細胞的脂肪生成和脂解作用的調節具影響力。
為了進一步讓產品能夠更接近脂肪ECM的結構，HCS令其HA支架的機械物理性質在楊氏模數(Young’s modulus)達到0.5kPa，這與天然脂肪組織ECM的數值相同。此外BIOMIMESYS® Adipose Tissue的孔徑範圍為70至170μm，提供足夠的空間既能讓培養液和營養物質流動循環，也能讓大型脆弱的初代脂肪細胞行細胞 – 細胞跟細胞 – 基質交互作用以讓細胞成熟。另外，這樣的結構也提供足夠的機械強度支持，讓這個水支架容易使用。
BIOMIMESYS® Adipose tissue能提高前脂肪細胞中的脂肪形成標記基因的表現：
● 早期表現基因如FABP4（脂肪酸結合蛋白）：
● 晚期表現基因如GLUT4（葡萄糖轉運蛋白）：
與在2D培養方式的培養脂肪細胞相比，在BIOMIMESYS® Adipose tissue 中培養的脂肪細胞，於生長時能呈現更好的分化表現，表現出更好的脂質累積：
相關資料
BIOMIMESYS® Adipose Tissue – 技術資料表
BIOMIMESYS® Adipose Tissue – 海報
BIOMIMESYS® Adipose Tissue – 出版文獻
BIOMIMESYS® Liver
BIOMIMESYS® Liver水支架的組成材料，包括與RGDS和半乳糖胺(galactosamine)接枝的玻尿酸、己二酸二酰肼交叉聯結劑和細胞外基質（ECM）蛋白質（膠原蛋白I和膠原蛋白IV），以模擬肝臟 – ECM的組成。SEM圖像顯示了BIOMEMISYS® Liver水凝膠的仿生結構，包括其膠原鏈。
細胞外基質(ECM)是決定細胞活性和活力的重要因素。肝細胞是由複雜的細胞外微結構所組成和維持，其ECM的化合物在肝功能調節中發揮巨大作用。而膠原蛋白、醣蛋白和醣胺聚醣（GAG）構成大部分肝臟的ECM; 這些分子也在細胞生理學中發揮重要作用。
BIOMIMESYS®Liver水支架
取自去細胞肝臟的ECM（左側）和 BIOMIMESYS® Liver（右側）
玻尿酸（HA）在肝組織的物理性質中具有重要作用。HA能隔離水以維持ECM的水合作用，並且提供潤滑功用以方便細胞運動和遷移。HA在新肝組織形成期間扮演重要角色，它能促進細胞增殖的活性。這些性質以及能在做移植時避免免疫反應的能力，讓HA非常適合用於3D細胞培養和體內治療(in vivo treatments)。
物理化學性質：
BIOMIMESYS® Liver水支架的機械物理性質具有0.6 kPa的楊氏模數，與肝臟ECM的範圍相當。這個水合支架為多孔結構，孔徑直徑範圍為60μm至130μm。
球狀細胞(Spheroid)的生長與發育： 提高培養存活時間
在比較用2D細胞跟3D細胞培養方式的培養實驗中，HCS培養了HepG2 – 初代人肝細胞和肝癌細胞株，發現細胞在3D培養中能保持存活更久。此外，初代人肝細胞在3D培養方式中保持其代謝活性的時間也較在2D培養中更長，甚至在夾心培養(sandwich culture)中也是如此。
維持肝細胞功能：形成膽管相關的基因 – HepG2
以共定位分析膽管網路成型時，肌動蛋白(actin)與MRP2基因表現
維持肝臟的代謝活動： 冷凍保存的人類肝細胞檢體
以BIOMIMESYS® Liver培養的肝細胞分泌的白蛋白，要比2D培養肝細胞分泌的量多20至30倍。
在以2D或3D培養7天後，進行基礎CYP活性的分析。
與夾心2D培養方式相比，使用BIOMIMESYS® Liver培養的細胞基礎CYP活性更高。
相關資料
BIOMIMESYS® Liver – 技術資料表
BIOMIMESYS® Liver – 海報
BIOMIMESYS® Brain
BIOMIMESYS® Brain是一個獨特並能立即使用(ready to use)的生物功能化玻尿酸（HA）水支架，適用於培養神經細胞。 BIOMIMESYS® Brain是透過雙重交叉鏈結反應來製造，鏈結的材料包括：腦細胞外基質的成分膠原蛋白I和膠原蛋白IV、纖連蛋白的細胞結合域（RGDS）、陽離子生物聚合物以及玻尿酸。BIOMIMESYS® Brain 提供了一個能讓神經元細胞進行長期培養的微環境。
為了更進一步接近天然腦細胞的ECM構成，HCS讓針對腦細胞培養的生物功能化玻尿酸基水支架的機械物理性質，具備0.1 kPa（軟水支架）的低楊氏模數，這個數值與天然的腦ECM相同。由於HCS一直希望能更完美地好模仿大腦結構的各種特性，因此BIOMIMESYS® Brain 的組成包含80％空白體積並具備高孔隙率，孔隙平均在150±30微米。
BIOMIMESYS® Brain 還提供了足夠的空間，給脆弱的神經元細胞進行細胞-細胞和細胞-基質交互作用需要的氣體、培養液和營養物的流動循環。同時其結構也提供足夠機械強度支持，讓這個水支架容易使用。
在BIOMIMESYS®Brain中接種後6,13和20天的多巴胺能神經元（Luhmes細胞）圖片。綠色：β3-微管蛋白，藍色：以Hoechst染色的細胞核; 比例尺=200μm
植入的神經元細胞能以球狀體形式在3D培養環境中生長。相較於以2D培養方式培養的細胞，以BIOMIMESYS®Brain培養的細胞能維持這個形狀較長時間。在觀察中也發現到球狀內神經突的形成（第6天，第13天），並且還會觀察到之後神經突在球狀體之間形成（第20天）。
細胞外基質（ECM）是由各種不同成分（GAG，膠原蛋白等）組成的複雜黏彈性系統，通常由纖維狀的微結構構成。
ECM的物理化學性質（組成和結構），在調節細胞功能如擴散、遷移、增殖和分化中扮演著關鍵角色。
為了能夠更完善地模擬腫瘤細胞的微環境， HCS Pharma開發了 BIOMIMESYS®Oncology ， 一種以己二酸二酰肼（ADH）去交叉鏈結膠原蛋白I跟玻尿酸（HA）的雙重穿透網狀（interpenetrating network, IPN）水支架。
BIOMIMESYS®Oncology的SEM切片觀察：切片放大倍數
HTC-116細胞 – 第30天 – DAPI（藍色）MitoTracker（黃色）Edu（綠色）合併顏色 – 10倍深層視圖
球狀細胞生長、活力，細胞增殖
BIOMIMESYS® Oncology 水支架提供與細胞結合位點的CD44和RHAMM，得以讓細胞進行細胞-基質和細胞-細胞交互作用。
在BIOMIMESYS® Oncology水支架中培養的癌細胞，能從培養的第5天開始增殖並聚集形成球狀體細胞。球狀體的大小和形成會隨以下因素變動：
●植入密度
●培養時間
●細胞類型
培養的細胞能至少存活28天。
在BIOMIMESYS®Oncology中生長的結腸直腸癌細胞
HT-29細胞 – 第7天 – DAPI（藍色）MitoTracker（黃色）
HTC-116細胞 – 第15天 – DAPI（藍色）MitoTracker（黃色）Edu（綠色）
HTC-116細胞 – 第30天 – DAPI（藍色）MitoTracker（黃色）Edu（綠色）以及合併顏色
相關資料
BIOMIMESYS® Oncology – 技術資料表
非公開: BIOMIMESYS® 3次元細胞培養技術
BIOMIMESYS®はHCS Pharma社（フランス、以下HCS社）により開発された、理想の生物学的特性を備えた細胞外マトリックス（ECM）を再現可能な3D培養技術です。
BIOMIMESYS®製品は水溶性のヒアルロン酸とその他ECM構成分子（コラーゲン、フィブロネクチンなど）をアジピン酸ジヒドラジド（ADH）で架橋することにより、生体内のECMを再現しています。
細胞外マトリックスにおいて、ヒアルロン酸はその特性を決定づける重要な生体高分子です。グリコサミノグリカン（GAG）の一つであるヒアルロン酸は、強固な重合構造により組織の構造を維持しています。また、ヒアルロン酸は水分子に対して強い親和性をもち吸水性が高く、様々な増殖因子と結合することが可能です。
HCS社は3D培養システムにヒアルロン酸を生体高分子のまま組み込むことに成功しました。ヒアルロン酸が持つすべての特性（構造・細胞接着能・保水性・シグナル伝達など）を保持することができるため、限りなく生体内環境に近いECMを再現可能です。特に、HCS社のBIOMIMESYS® 3Dテクノロジーは親水性でありながら強固な構造をもつという、他社製品にはない2つの特性を併せ持っています。HCS社はこの3D培養システムを「ハイドロスキャフォールド」と名付けました。
臓器によって、ECMの構成成分や組成は異なります。細胞の密度や弾性、多孔率などの調整により、BIOMIMESYS® 3Dテクノロジーは各臓器におけるECM環境の正確な再現を可能にしました。
(BIOMIMESYS®のウェブサイトはこちら)
製品紹介（ページ内の項目へ飛びます）
BIOMIMESYS® Adipose tissue
BIOMIMESYS® Adipose Tissueは、機能化されたハイドロスキャフォールドであり、Ⅰ型コラーゲン、Ⅵ型コラーゲン、フィブロネクチンの細胞接着部位（RGDS）の構成成分により脂肪組織の細胞外マトリックス（ECM）を再現しています。BIOMIMESYS® Adipose Tissueは誘導性の微細環境を形成し、前駆脂肪細胞の完全な分化を可能にします。前駆脂肪細胞はin vivo環境と同様に円形の脂肪細胞への分化が誘導され、脂肪細胞の脂肪生成および脂肪分解に関わる代表的な調節因子に対して用量応答を示します。
BIOMIMESYS® Adipose Tissueの架橋ヒアルロン酸をベースとした重合構造は、脂肪組織ECMと同様のヤング率（0.5 kPa）を有し、直径70~170 µmの小孔が多数存在します。このためBIOMIMESYS® Adipose Tissueは媒質や栄養成分の循環の妨げにならず、細胞-細胞または細胞-ECMの相互作用により、大型で脆弱な初期脂肪細胞の安定した成熟を可能にします。また、この重合構造はハイドロスキャフォールドの機械的強度も高めているため、容易な取り扱いも可能にしています。
BIOMIMESYS® Adipose Tissueは前駆脂肪細胞の脂肪形成において、より多くのマーカー遺伝子の発現を可能にします。
- ●FABP4などの早期発現遺伝子
●GLUT4などの後期発現遺伝子
BIOMIMESYS® Adipose Tissueを用いて培養した脂肪細胞は2D培養よりも分化能が優れており、より多くの脂肪を蓄積することが可能です。
関連資料
BIOMIMESYS® Adipose Tissue – テクニカルデータシート
BIOMIMESYS® Adipose Tissue – ポスター
BIOMIMESYS® Adipose Tissue – 文献
BIOMIMESYS® Liver
BIOMIMESYS® Liverのハイドロスキャフォールドは肝臓の細胞外マトリックス（ECM）環境を再現するため、フィブロネクチンの細胞接着部位（RGDS）、ガラクトサミン修飾ヒアルロン酸、アジピン酸ジヒドラジド架橋剤、ECM構成コラーゲン（Ⅰ型・Ⅵ型コラーゲン）により構成されています。走査型顕微鏡画像はコラーゲン鎖をもつハイドロスキャッフォールドの生体模倣的構造を示しています。
ECMの特性は、細胞の活性および寿命を決定づける重要な因子の一つです。肝細胞は複雑な細胞外微小環境により維持管理されており、ECMの組成が肝機能の調節機能を大きく左右します。肝臓のECMは大半がコラーゲン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（GAG）で構成されており、それぞれが重要な細胞生理学的機能を有しています。
BIOMIMESYS® Liver ハイドロスキャフォールド
BIOMIMESYS® Liver (右) および脱細胞処理された肝臓のECM(左)
ヒアルロン酸（HA）は肝組織の物理的性質に大きく影響を与えるECM構成成分です。HAはECMを湿潤に保つため分子内に水を貯蔵する性質があり、細胞の運動性と遊走性を高める潤滑剤としての機能も持ちます。また、新しい肝組織が作られる際、増殖細胞の活性化を促進するためにHAの存在は欠かせません。これらの特徴に加え、移植時に免疫応答が起きにくい特性から、HAは3D細胞培養やin vivoでの治療に適した基質であるといえます。
物理化学的性質:
BIOMIMESYS® Liverハイドロスキャフォールドは肝組織ECMと同様のヤング率（0.6kPa）を示します。ハイドロスキャッフォールドは有孔性であり、直径60~130 µmの小孔が多数存在します。
スフェロイド形成：
3D培養されたHepG2などの主要なヒト肝細胞と肝癌細胞の培養株は、2D培養よりも長期間生存が可能です。また、サンドウィッチ法による培養においても2D培養と比べて代謝機能をより長い時間維持することが可能です。
肝細胞の機能を維持する：毛細胆管形成－HepG2
ActinおよびMRP2の共局在による毛細胆管ネットワークの形成
肝臓の代謝機能を維持する：ヒト肝細胞の凍結保存検体
BIOMIMESYS® Liverでは2D培養と比べ、20~30倍のアルブミンが分泌されます。
基底CYP活性は2D培養と3D培養のそれぞれで、培養から7日後に測定されました。
サンドイッチ法による培養では、BIOMIMESYS® Liverでより高い基底CYP活性がみられました。
関連資料
BIOMIMESYS® Liver – テクニカルデータシート
BIOMIMESYS® Liver – ポスター
BIOMIMESYS® Brain
BIOMIMESYS® Brainは神経細胞培養に適した、即時使用可能なヒアルロン酸ハイドロスキャフォールドです。BIOMIMESYS® Brainの独特な重合構造は脳組織の細胞外マトリックス（ECM）構成成分（Ⅳ型コラーゲン・フィブロネクチンの細胞接着部位（RGDS）・陽イオン性生体高分子・ヒアルロン酸）の二重架橋により形成されています。ハイドロスキャフォールドがもつ誘導性の微細環境は、神経細胞の長期培養を可能にしています。
BIOMIMESYS® Brainの架橋ヒアルロン酸をベースにした重合構造は、脳組織ECMと同様にとても低いヤング率（0.1 kPa）を有し、とても柔らかなハイドロスキャッフォールドを形成しています。また、脳の構造特性をより再現するため、BIOMIMESYS® Brainは体積の80％が、直径150±30µmの小孔が形成する多孔性の空洞により占められています。
BIOMIMESYS® Brainは一つ一つの孔の直径が大きいため神経細胞にガス・媒質・栄養を届ける際の妨げにならず、脆弱な神経細胞において効率の良い細胞-細胞および細胞-ECMの相互作用を可能にします。この重合構造はハイドロスキャフォールドの容易な取り扱いに必要な機械的強度も有しています。
BIOMIMESYS® Brain中で培養したドーパミン作動性ニューロン（Luhmes細胞）。（6日、13日、20日後）
緑：beta3-tubulin、青：核（ヘキスト）、スケールバー：200 um
播種された神経細胞はスフェロイドの形で3D培養が可能です。BIOMIMESYS® Brain を使用することで、2D培養よりも長期間培養を維持することができます。培養6日および13日でスフェロイド内部の神経突起が確認でき、培養20日でスフェロイド間の神経突起が確認できます。
関連資料
BIOMIMESYS® Brain – テクニカルデータシート
BIOMIMESYS® Oncology
細胞外マトリックス（ECM）は粘弾性をもつ複雑なシステムであり、異なる特性を持つ様々な構成成分（GAG・コラーゲンなど）が繊維状微細構造を形成しています。
ECMの物理化学的特性（組成と構造）は細胞の持つ様々な機能（伸展・遊走・増殖・分化など）を調節する際に重要な役割を果たします。
腫瘍組織の微細環境をより正確に再現するため、HCS社はBIOMIMESYS® Oncologyを開発いたしました。BIOMIMESYS® Oncologyはヒアルロン酸（HA）とⅠ型コラーゲンをアジピン酸ジヒドラジド（ADH）で架橋し構成したECMからなる、相互侵入高分子網目（IPN）ハイドロスキャッフォールドです。
SEMによる観察
HTC-116 Cells – Day 30 – DAPI (blue) MitoTracker (Yellow) Edu (Green) merged colors – 10 deep layers view
スフェロイド形成、生存性、細胞増殖
BIOMIMESYS® OncologyのハイドロスキャフォールドはCD44やRHAMMとの細胞結合部位を有し、細胞-ECMおよび細胞-細胞の相互作用を可能にします。
BIOMIMESYS® Oncologyのハイドロスキャフォールドを用いた癌細胞の増殖試験では、培養5日ほどでスフェロイドが形成され始めます。スフェロイドの大きさと形は播種密度、細胞の種類、培養時間により異なり、最長28日間の培養が可能です。
BIOMIMESYS® Oncology中の結腸直腸癌の細胞成長
HT-29 Cells – Day 7 – DAPI (blue) MitoTracker (Yellow)
HTC-116 Cells – Day 15 – DAPI (blue) MitoTracker (Yellow) Edu (Green)
HTC-116 Cells – Day 30 – DAPI (blue) MitoTracker (Yellow) Edu (Green) and merged colors
関連資料
BIOMIMESYS® Oncology – テクニカルデータシート
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